SPI-Mark™胶体金试剂

如何选择金标液

抗体同样品孵化的目的，不管样品为切片、悬浮液细胞、组织切片、印迹膜、快速诊断试验检测，都在于使特定信号最大程度地加强，使非特定的背景信号最大程度地减弱。如何利用金标液得到最佳效果对此有详细说明，这里讨论的对金标液的最初选择也是非常重要的。

直接或间接标记(抗体)
如下所述，金标液可用于直接或间接标记抗体。直接法中，金粒与一级抗体相结合，不管其是单克隆抗体还是多克隆抗体。这将进行单一孵化，并提供最简单的探测系统。在间接法中，先用一级未标记抗体在样品中定位抗原。接着用金标记二级抗体探测一级抗体。这些金标记二级抗体几乎都是亲和纯化多克隆抗体。这样，信号就扩大了，微粒尺寸通常比直接孵化要大10x倍。

选择最合适的系统取决于探测成分的类型，以及可用的结合蛋白质。下面是关于这一选择的一些说明。

间接法也可用于没有与一级抗体相配的合适金标二级抗体的情形。举例来说，如果未标记的一级抗体来自猪，而没有相配的金标记抗猪的二级抗体，那么可以用未标记的抗猪(如兔抗猪)二级抗体，然后用金标记的三级抗体(如山羊抗兔)来探测二级抗体。

间接法是细胞和组织研究中最常见的方法，不需要标记每个一级抗体。它为使用同样的一级样品来探测一级抗体提供了普遍的方法。即所有兔抗体可以用山羊抗兔金标液来探测，等等。间接法的使用时间比直接法要长，因为它需要两(或三)次单独孵化，但间接法使用最为广泛。下表列出了可以用于某些一级抗体的二级金标抗体。

一级抗体	二级抗体(金标记)	产品种类
兔 IgG	山羊抗兔 IgG (H+L)	GAR
鼠 IgG	山羊抗鼠 IgG(H)(人 abs) 山羊抗鼠 IgG(H+L)(人 abs) 山羊抗鼠 IgG(大鼠 abs)	GAM GMHL GMTA
鼠 IgM	山羊抗鼠 IgM(特定mu链)	GAMM
鼠 IgG 或鼠 IgM (混合或未知)	山羊抗鼠 IgG+IgM (H+L)(人 abs)	GAF
鼠 IgA	山羊抗鼠 IgA	GAMA
鼠 IgG+IgM+IgA	山羊抗鼠 IgG+IgM+IgA (多价)	GAMP
大鼠 IgG	山羊抗大鼠 IgG (H+L) (人 abs) 山羊抗大鼠 IgG(H+L) (鼠 abs)	GAT GTMA
人 IgG	山羊抗人 IgG(H+L)(特定γ链) 山羊抗人 IgG(H+L)	GAH GAHL
人 IgM	山羊抗人 IgM	GAHM
豚鼠 IgG	山羊抗豚鼠 IgG (H+L)	GAG
鸡 IgG	兔抗鸡 IgG (H+L)	RCHL
山羊 IgG	兔抗山羊 IgG (H+L) 兔抗山羊 IgG (H+L)(人 abs)	RAG RGHA
绵羊 IgG	驴抗绵羊 IgG (H+L)	DAS

注：
(H+L) = 特定重链和轻链
(H) = 特定重链
(人abs) = 被吸收了人类血清蛋白
(鼠 abs) = 被吸收了鼠血清蛋白
(大鼠 abs) = 被吸收了大鼠血清蛋白

吸收血清蛋白
如上表所示，抗体金标液中的某些标本的血清蛋白被吸收了，这在每节都有详细说明。这种吸收将那些标本的交叉反应降到了最小。

何时使用F(ab')部分？
在某些应用中，由于抗体金标液Fc区域对组织成分(称作Fc受体)的吸引力，背景标记可能是一个问题。通常，只要将普通的血清蛋白应用到一级抗体(见如何利用金标液得到最佳效果)中，即可轻易地阻止这个问题。然而，如果问题仍然存在，则可能需要使用金标记的抗体F(ab')部分。每节都列有这些结合物。

何时使用抗体、蛋白质A、蛋白质G或蛋白质A/G？
蛋白质A(PAG)、蛋白质G(PGG)和蛋白质A/G(AG)都是单独的蛋白质，通过与一级抗体的Fc部分相结合，将类似于二级抗体。在某些情形下，它们可代替二级抗体使用。然而，与二级抗体不同的是，这些蛋白质在一级IgG上只有一个结合点。它们与IgM或IgA分子结合力不强。

与蛋白质A相比，二级抗体提供的信号更强

这些蛋白质的优点在于，它们能普遍用于大量一级抗体样品。如下表所示，它们对不同样品的IgG分子结合力不一样。然而，如果可能的话，我们还是推荐使用样品的特定二级抗体。

特定Ig结合蛋白质的相关亲和力

一级抗体	蛋白质A：金(PAG)	蛋白质G：金(PGG)	蛋白质A/G：金(AG)
兔 IgG	+++	+++	+++
鼠 IgG IgM IgA	++ +/- +/-	++ +/- +/-	++ +/- +/-
大鼠 IgG	+/-	+	+++
人 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgM	+++ +++ +/- +++ + +	+++ +++ +++ +++ - -	+++ +++ +++ +++ - -
豚鼠 IgG	++	++	++
山羊 IgG	+/-	++	+++
牛 IgG	++	++	++
绵羊 IgG	+/-	++	+++
鸡 IgG	+/-	+	+/-

链霉亲合素，还是山羊抗生物素？
间接探测生物素化一级抗体或核酸探针，需要选择链霉亲合素：金或羊抗生物素：金标液。一直以来，由于链霉亲合素与生物素的亲合力常数非常高，它被经常用于探测生物素。然而，最近发现，羊抗生物素在与金粒结合时，探测生物素的灵敏性比链霉亲合素更高。这是因为抗生素分子(160,000 道尔顿)比链霉亲合素的分子(40,000道尔顿)更大，以及由于Fc上金粒结合点与抗体F(ab')结合区域之间的距离。在使用较大金粒时尤其如此，但5nm和1nm的金标液则没有意义了。来自山羊抗体非特定性吸引的背景可能引起问题，链霉亲合素可使结果更清洁。我们推荐在生物素探测开始时，使用山羊抗生物素。

阳离子金
阳离子金可用于细胞和组织(1)中阴离子(即负电荷)位点的高度灵敏而不连续的显微镜研究。金标液通过与多聚赖氨酸的小心结合而形成，多聚赖氨酸是一种非常积极的氨基酸链。切片与稀释的阳离子金标液简单孵化，即能显现带净负电荷的亚细胞位点。使用不同粒径的阳离子金可以放大不同倍率观察电荷分布。

大多数真核细胞表面带净负电荷，它来自阴离子质膜成分。这种电荷分布被认为对各种可溶性高分子穿越细胞壁的移动非常重要。因此，通过与相邻细胞的交互作用，可以研究表面电荷在细胞行为中的作用。在体外和体内研究中，阳离子金也可以有效用于研究内吞作用对阴离子材料的吸收。

注(1): Bush MS and Allt G (1990) "Blood nerve barrier: distribution of anionic sites on the endothelial plasma membrane and basal lamina." Brain Res 535, 181 -188.

如何选择金粒粒度
不同粒度大小都可以结合蛋白质和高分子。原则上，金粒越小，样品标记强度越大。这是因为小的金粒，减小了抗原探测的位阻。通常，分子量为160,000道尔顿的抗体的线性尺寸为8nm。因而，1nm的金粒，吸附于Fc区域，将很难阻止抗体行为。20nm的金粒，虽然可见性更强，然而由于其接近抗体的抗原结合区域，将产生更大的位阻。此外，较大颗粒之间的电荷斥力更强，将减少可以与抗原相结合的标记抗体数目。

不同的粒度大小适合于不同种类的应用：

a) 光学显微镜(见光学显微镜部分)
金粒在光学显微镜明视场中不容易观察到。它们必须进行银加强，以增强可见性。粒度越小，样品上能标记的金粒数目越多，每个金粒又能进行银加强以让信号的可见度最强。可选择1nm至5nm的金标液。5nm的金标液是最标准的，推荐在最初研究时使用。如果需要更大的标记强度，则可以使用1nm金标液。不管哪种情况，金信号都将进行银加强，以在光学显微镜下观察。在需要细胞和组织渗透(如预嵌入标记)时，1nm金标液特别有用。银加强在银加强套装一页中有详细介绍。

b)透射电子显微镜(见EM金标液)
在电子显微镜中可使用任何粒度的金标液。在低放大倍率下，较大的微粒(如15-30nm)更容易观察到。高放大倍率下，首选较小的粒度(如5-10nm)。而且，小的粒度，标记强度更高，可以进行银加强，在高标记强度的基础上形成较大的微粒。如果需要超高灵敏度，可使用1nm金粒，但也只有在银加强后才能观察到。

如果刚开始使用EM免疫金标记或是在不同放大倍率下进行研究，推荐使用10nm金标液。

扫描电子显微镜
扫描显微镜的分辨率显示，应该使用大的金粒(如>20nm)，通过反向散射电子信号来进行探测。然而，就像我们上面提到的，小的金粒标记强度更高，而且可以使用LM/EM银加强套装SEKL15进行银加强。因此，我们将推荐在SEM研究中，使用20或30nm的金标液用来直接(未加强的)观察，使用5nm金标液进行几分钟的简单银加强后在低放大倍率下观察。对后一种方法，每个金粒可在3-5分钟内增长至约30nm的球形。用水冲洗即可停止反应。

印迹(见用于印迹蛋白质的金标液)
在印迹应用中，将金标液用于固定在硝化纤维膜上的蛋白质，可选择1nm至20nm的金标液。即使5nm的金标液在随后进行银加强，便也能有效应用(LM级)。如果需要超高灵敏度，最好使用1nm的金标液，并进行银加强。然而，20nm的金标液可在不进行银加强的情况下，直接识别固定膜上的印迹蛋白质。1nm和5nm(LM级)金标液，由于它们能减小位阻，增强溶液中的颗粒浓度，经大大稀释后所得到的最终强度与20nm金标液一样。1nm和5nm(LM)金粒必须用印迹银加强套装进行加强。

甘油或无甘油？
SPI-Mark标准金标液被置于装有20%甘油的缓冲器中，这样能保存良好的冰冻性。大多数情况下，这不会产生任何困难，因为金标液可以高度稀释后使用，样品被固定和嵌入。然而，如果使用高浓度的金标液(如1:2)，较高的甘油含量可能可能影响到细胞标记。这些样品可能包括悬浮液或细胞培养中的固定细胞，甘油可能导致这些细胞收缩。如此高浓度的甘油也可能导致EM下金粒的不透明，甚至可能增加粘性，减缓标记速度。对这类应用，我们推荐使用不含甘油的金标液(产品编号相同，但标记为无甘油-NG)。

技术援助
除了选择抗体和粒度，选择合适的金标液还取决于正确使用样品制备和孵化协议。在SPI Supplies，我们很愿意对这些方法提供援助，很乐意帮助所有特定应用选择合适的金标液。

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