SPI-Mark™ 胶体金试剂

如何得到免疫金标记的最佳效果

所有SPI-Mark金试剂和银试剂都有正确用于免疫标记的详细技术说明。除提供推荐稀释浓度、缓冲液、封闭剂等以外，还提供使用协议。每种产品都配有详细的数据表，提供规格和性能信息。我们的客户服务组随时为不同领域应用我们的试剂提供持续性的建议，包括那些非常规使用。

免疫标记程序的最初目的是为了使特定信号最大化、非特定背景最小化。EM切片、LM切片和膜免疫印迹都是如此。免疫标记程序的结果主要受到样品制备和孵化程序的限制。这里给出的参考资料介绍了许多LM、EM和印迹应用的免疫标记最佳条件和协议。虽然不可能为每种应用介绍免疫标记程序，但如果顾客要求，我们为每种标本类型的基本方法提供额外协议。这在本页的最后有介绍。

样品制备 正确的样品制备程序对适当标记细胞和组织中的抗原是至关重要的。通常用于EM的保存超微结构的方法和用于LM的保存形态的方法，必须进行修改，以确保抗原不仅得到保留，而且可以用于标记。这经常需要在结构方面做出妥协，但是，仔细挑选制备方法可以使结构细节和免疫化学标记很好地结合起来。

显微镜制备程序中抗原性的潜在损失

在LM和EM研究中，细胞和组织切片可通过预嵌入、后嵌入或冰冻技术进行研究。此外，整个细胞可在细胞纤维、细胞涂片、细胞培养以及细胞悬浮液中进行观察。

应该认识到，制备程序的每一步都可能因为萃取、变更或掩蔽而造成抗原性的损失。这些损失累积起来可能大大降低全面标记，除非每一步都进行了最优化处理。通常这只能依靠经验，但下面提供了一些准则。

a)固定
细胞和组织可以固定后进行观察，也可以在未固定状态下进行标记。组织固定也必须保存抗原性，不能以牺牲结构特征为代价。固定液使蛋白质变性，或者通过凝结(如丙酮或甲醇)，或者通过形成附加的交联化合物(如乙醛)，或两者兼而有之。固定形成的联合体难免与未固定的蛋白质不同，不管是化学方面还是抗原性方面。每种组织都需要专门的固定协议。举例来说，如果组织中有太多的交联，蛋白质浓度高，可能掩蔽许多抗原。另一方面，如果组织松散，蛋白质含量低，则可能分解，不能充分固定，抗原可能被轻易冲掉。根据用来探测抗原的抗体种类的不同，可能并不需要完全保存研究中的蛋白质，如果至少保存了特异性抗原。固定液种类详列于下表。

对许多组织来说，最好的折衷办法是将甲醛(如2-4%)与弱戊二醛(如0.1%)混合，甲醛可快速稳定、低交联，戊二醛能较好地保存结构。细胞学研究，可能首选沉淀或凝结固定，如丙酮或甲醇。甲醛丙酮通常也用来固定细胞制备。在细胞研究的某些情况下，仅仅在空气中干燥也许就能够为免疫标记保存足够的抗原性。

电子显微镜固定后，通常需要使用四氧化饿，以保存膜成分，并提供图像对比。然而，将饿引入组织，并不总是合适的。最近建议改而使用鞣酸⁵。

不管采用何种固定方法，必须起到两个作用：保存组织的结构和抗原成分，而不引入任何可能影响标记的物质。有些情况下，在组织中引入重金属，如饿或铀，可能导致非特异性标记增强，必须谨慎对待。

b) 冲洗
在固定后，对组织进行彻底冲洗极为重要。只要组织已经固定，便需要冲洗，以除去多余的乙醛或其它残留固定液，这些残留的固定液可能引起非特异性标记。有时用氯化铵对组织进行淬火处理，以中和醛类。冲洗最好在缓冲液中进行，缓冲液的弹性与天然组织状态类似。

c) 嵌入
LM研究中，组织可嵌入石蜡，LM或EM研究中，组织可嵌入树脂。在这两种情况下，嵌入都应该保存好抗原，不能牺牲结构信息。通常有两种树脂，环氧树脂和丙烯酸树脂。环氧树脂具有芬芳结构，交联坚固。丙烯酸树脂交联较弱。环氧树脂具有疏水性，而丙烯酸树脂可能具疏水性，也可能具亲水性。环氧树脂能最好地保存结构，具有极好的稳定性，丙烯酸树脂则能进行最好的免疫标记。这是因为丙烯酸树脂切割时，在切片表面显示蛋白质，而且它们容易弄湿，这样在后面的孵化中，抗体就更容易接近。

用于EM和LM制备的树脂


    树脂种类
                 交叉
                 连接
                            亲水性
                                         结构/稳定性
                                                        抗原
                                                        保存/接近

    环氧
    Araldite
    Epon
                 高
                 高
                            疏水性
                            疏水性
                                               +++
                                               +++
                                                                +
                                                                +
    丙烯酸
    UNICRYL
    Lowicryl
    LR White
    LR Gold
    Methacrylate

                      -
                      -
                      -
                      -
                      -
                            亲水性
                            亲水性
                            亲水性
                            亲水性
                            +/- 亲水性
                                               ++
                                               ++
                                               ++
                                               ++
                                                +
                                                               +++
                                                                ++
                                                                ++
                                                                ++
                                                                +

为了得到最佳结果，必须进行折衷，通常是选择具有中等交联性的极性(亲水)树脂。流行的丙烯酸树脂配方由UNICRYL提供，它的免疫标记特征极好，稳定性高、结构保存好。UNICRYL，与许多其它丙烯酸树脂一样，可以在低温下嵌入。这样能确保脱水过程中不会将一些重要成分萃取出来，并且确保聚合过程中不会发生温度过高，温度过高可能损害组织抗原。

d)印迹
通过Western印迹或斑点印迹将蛋白质印于膜上，确保蛋白质完全转移至膜非常重要。然后，必须用中性蛋白质或表面活性剂(如BSA或Tween 20)阻止膜，填充空置部位，防止非特异性背景标记。然后以类似于孵化组织切片的方式孵化膜。将膜浸于PROTOGOLD溶液，PROTOGOLD溶液将所有的蛋白质染上胶体金，呈红色，这样能显出完整的蛋白质带/点图案。这能显示所有蛋白质带的部位(见Protogold部分)。然后，可将另一完全相同的膜与合适的特异性抗体孵化，以识别固定于膜上的特异性蛋白质。膜与金标记二级抗体一起孵化，金粒积聚，显红色，从而显示特异性蛋白质带。为了使信号最好，背景最弱，每一步骤后进行彻底清洗是很重要的。

非特异性标记的可能来源

孵化
为了使特异性信号最强，非特异性背景最弱，了解样品制备和随后的孵化过程中所有可能影响结果的因素是非常重要的。下面的数字显示，非特异性背景的最常见来源，通过控制可识别这些背景，并成功消除。这些因素适用于所有种类的组织，不论是EM、LM或免疫印迹膜。

a) 一级抗体
一级抗体应该具有高滴度、最高的特异性纯度，可以进行最大程度的稀释。交叉反应要低，尤其是与标本组织。低质量一级抗体是标记过程特异性信号弱、背景信号强的最主要的原因。缓冲液成分和pH值对孵化非常重要。通常选择标准TBS或PBS缓冲液和适当的添加物，来维持低背景(见下文)。孵化过程中，样品必须用缓冲液彻底清洗。

确定最佳背景标记信号的典型稀释协议

(b) 二级抗体
高质量的二级抗体是标记特异性一级抗体必不可少的，而且背景信号弱。SPI-Mark金标液经亲和纯化，质量极好。它们悬浮于Tris或磷酸盐缓冲液中，与叠氮钠防腐剂用于显微镜或免疫印迹，它们在合适的条件下可存储好几年。这是因为我们的金标液不含游离抗体，所有抗体被安全吸附于金表面。此外，单态比例非常高，保证了存储过程不会形成集群。

高滴度和高纯度意味着它们可经高度稀释(通常为1/100 - 1/400)后，在下面所示的典型孵化缓冲液中孵化，以减弱非特异性背景，增强特异性信号。甚至高度稀释后(1/1000以上)，金标液还是极为稳定，可长期孵化。

(c) 稀释
创建一项新协议时，需要确定一级抗体和金标记二级抗体的最佳浓度。这通常是首先用几部分分别与一级抗体的不同稀释浓度进行孵化，浓度值在适当的范围内变化，如1/100至1/10,000。一级孵化之后，进行二级孵化，使用固定浓度，如1/100的金标记二级抗体。一级抗体的稀释得到最佳信号，从而确定了背景。然后重复该程序，将确定的一级抗体浓度作为常数，同选定范围内的金标稀释浓度进行孵化，如1/10至1/400。观察第二组结果，将知道进一步实验应当选择的金标液稀释浓度。下表说明了这种连续稀释的典型程序。

在一级孵化和二级孵化中，可以通过搅动标本或摇晃试剂，不断将新鲜的溶液带至组织表面的目标蛋白质，从而增强灵敏性。如果抗体溶液能接受，可稍微升高温度(可达37C)进行孵化。

c) 阻止
组织和细胞表面的非特异性反应活性部位和印迹膜的空置部位，在将抗体应用于样品前，可能需要阻止。非特异性标记产生的原因可能来自下表所示的来源。每一背景来源都需要在抗体孵化之前或之中进行专门的阻止程序，如下表所示。同时，在每件产品的BBI技术资料小册子中也有介绍。阻止试剂由BBI提供，并单独列于阻止试剂部分。

免疫标记背景的典型来源及适当的补救方法

背景溶液来源
1. 带高正电荷的组织成分(如组蛋白、胶原质、弹性蛋白、组胺中的残留赖氨酸) 吸引带负电荷的金粒(详见金标简介)
a) 升高孵化缓冲液中的pH值，减少正电荷
b) 增加缓冲液中的盐含量，缩小金粒电场
c) 在孵化之前或之中用BSA阻止组织
2. 抗体对组织成分的非特异性吸引，如组织醛、固定液残留、或普通非特异性结合成分
a) 在孵化之前和孵化之中用BSA阻止组织
3. 疏水组织成分(如残留色氨酸)吸引疏水金粒(详见金标简介)
a) 在孵化缓冲液中加入表面活性剂，如Tween 20(如0.1-1%)
4. 含硫磺的组织成分(如残留半胱氨酸、环氧树脂)通过与格结合吸引金粒(详见金标简介)。在金缓冲液中增加BSA(如 5%)，使金在应用于切片前，彻底包上硫磺(注：不添加凝胶，因为凝胶将增加金对切片的吸引力)。
5.组织受体吸引非特异性二级抗体(如金标记山羊抗兔)
a) 在一级孵化前，用普通血清(如10%的普通山羊血清)阻止组织切片/膜。*
b) 在孵化缓冲液中加入普通血清(如1%的普通山羊血清，阻止(山羊)受体部位。*
c) 使用F'ab金标液(如金标记山羊(F'ab)抗兔)(详见第3部分)

典型孵化缓冲液，适合LM和EM孵化，它的成分可消除上述背景来源，如下所示：

典型孵化缓冲液
PBS 或 TBS
+ 1% 普通血清* (如山羊)**
+ 0.1% Tween 20
+ 1% BSA + 0.1% 叠氮化钠，调至pH 8.2.

这种缓冲液可用于孵化协议的每个步骤，最后用水冲洗干净。

注： * 血清不能与蛋白质A、蛋白质G或蛋白质AG金标液一起使用，因为它们会结合IgG分子。

** 选择与金标记抗体相应的血清。在这个例子中，选择山羊是因为使用了山羊抗兔金标液。

d) 控制
为了确定信号是否真实，并将其与背景信号进行区分，必须使用积极控制和消极控制。这些控制进行起来都很简单，所有着色协议都必须将其纳入。消极控制通常包括：

省略一级抗体；使用相同标本的非特异性一级抗体；在孵化前，用抗原吸收一级抗体；使用非特异性二级抗体。

这些消极控制将有助于识别所有非特异性背景来源。良好的积极控制使用高抗原含量的标本，检测整个标记系统。每种产品的BBI技术指导小册子都对控制进行了详细说明。

对于LM、EM和印迹应用，正确使用银加强程序同样也是非常重要的，可以将信号最大化，避免非特异性背景。这些程序详见我们的银加强部分。

参考文献
1. Hayat MA (ed) (1989-91) "Colloidal Gold. Principles. Methods and Applications". Vols 1-3, Academic press, London.*

2. Bullock GR and Petrusz P (eds) (1982-90) "Techniques in Immunocytochemistry" Vols 1, 2, 3, and 4, Academic Press, London.*

3. Baker JR (1970) "Principles of Biological Microtechnique", Methuen, London.

4. Lillie RD (1965), Histopathologic Technique and practical Histochemistry, 3rd ed, McGraw Hill, New York.

5. Berryman MA, et al (1992) Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J Histochem Cytochem 40, 6, 845-857

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