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SPI-Chem™“低酸”GMA套装，LM应用

使用说明

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SPI-Chem™ 低酸GMA水溶性嵌入套装
光学显微镜应用

SPI #02640-AB使用说明

注意：

在使用套装前，请通读容器标签上的所有说明与警示。

简介：

使低酸GMA适合用作光学显微镜(LM)嵌入介质的特征包括：

配方：(Cole和Sykes，1974)

A. 未聚合的GMA：
100.00 ml甲基丙烯酸乙二酯(酸含量低)。
**0.15 9 过氧化苯甲酰。
5.00 ml 聚乙二醇400或200。

充分混合，存储于棕色玻璃瓶中，放入冷藏柜。溶液可稳定存放6个月以上。打开以前，让溶液达到室温，以防止冷凝污染溶液。

注：
这种混合物可用酒和水稀释，也可不稀释，用于最终渗透。它不能用来代替预聚合GMA，也不能用作制备预聚合GMA的储备溶液。

B. 预聚合GMA：
100.00 ml 甲基丙烯酸乙二酯
**0.15 g 过氧化苯甲酰

充分混合，然后将足够多的溶液倒入125 ml或250 ml锥形烧瓶(Pyrex)，形成薄(5至7 mm)层。在本生灯上缓慢加热，并不断搅拌。溶液颜色变深(至黄-橙)，并开始变浓时，即发生聚合。当溶液开始聚合时，迅速将烧瓶放入冰水浴中，并用力搅拌，直到溶液冷却至冰水浴的温度。聚合是放热反应，一旦聚合开始，必须迅速冷却，以防止在烧瓶中迅速完全聚合。如果初次加热并冷却后，并没有达到适当的粘度，根据需要多次重复该程序，以达到理想粘度。适当预聚合的GMA在冰水温度下的粘度应和浓果汁的粘度一样。也就是说，溶液中的小气泡应当缓慢上升到表面。

一旦得到适当的粘度，让溶液达到室温，然后在每100 ml预聚合GMA中加入5.0 ml聚乙醇 400(或200)。充分混合(在磁力搅拌器上放置1小时)。预聚合溶液可在冷藏柜中存储2个月以上。预聚合的目的是“预收缩”GMA。未聚合GMA可能收缩5%的体积，预聚合GMA收缩 体积不到1%。

*特别注意事项：所有混合和/或加热操作必须一直在通风橱中进行。液体GMA成分可使导致一些人产生接触性皮炎和过敏反应。使用橡胶手术手套似乎有助于防止皮炎。聚合GMA无毒。

**避免过氧化苯甲酰失去水分，因为干燥材料的危险性要大得多，而且燃烧力强。在100°F(38°C)下储存，可保持活性。

定色、脱水、渗透和嵌入

定色和漂洗小(2 mm厚)片组织。
(有许多定色程序可以使用，但推荐的程序为：1%戊二醛缓冲液， 和10%福尔马林缓冲液。

通常使用的两种脱水/渗透方法：

A. 第一种方法不需要酒精脱水，建议用于所有水基定色剂。

B. 第二种方法在渗透前需要酒精脱水，建议用于非水基定色剂。

方法 A： (水性)

1. 将漂洗好的组织浸入85%的GMA水溶液--30分钟。降低温度至4-8°C，可增加GMA在水中的溶解度。

2. 浸入97%的GMA水溶液--30分钟。然后进行下面的步骤#3。可在冰水浴或冷藏库中进行脱水和渗透，以将细胞中温敏成分的损失减到最小。

方法 B：(酒精)

1. 用浓度递增的酒精水溶液，至绝对无水酒精，按照通常方式对组织进行脱水。

2. 将组织依次通过浓度递增的GMA酒精溶液(20、40、60和80的GMA无水酒精溶液)--每次30分钟。然后进行下面的步骤#3。精密组织应当以每天更换2次的速度通过GMA酒精溶液，依次通过GMA需要好几天的时间。而较为粗糙的组织则可从100%的无水酒精中直接转换到100%的GMA中。无论如何，组织在100%的GMA中至少放置12小时。

3. 浸入100%的GMA(未聚合)--12小时以上。

4. 将渗透组织和一两滴预聚合GMA放入00型号凝胶胶囊，并按照需要确定方向。用预聚合GMA填充胶囊至顶部，插入识别标签，然后盖上。氧气抑制聚合。如果GMA中有气泡，聚合前，让胶囊在室温下保持30分钟，以除去组织中的气泡。

5. 将胶囊放在胶囊架上，然后放入紫外线仪器中，直到聚合(12-24小时)。(Cole，1968)。

UV聚合设备中的温度在聚合过程中将升高，高出周围温度。如果需要保存热敏细胞成分，将聚合设备放入冷藏库中，-16°C。周围温度为-16°C，GMA的温度将约为2至4°C。可用热聚合代替UV聚合。将胶囊在40°C放置24小时，然后在60°C下放置，直到塑胶变硬(2天以上)。当塑胶上表面呈白色，或表面不能用拇指甲留下凹痕， 塑胶可视为已聚合。

6. 凝胶胶囊在水中浸泡变软后，可以除去。

7. 聚合块可在室温下无限期存储。

8.修整：
用清洁、干燥的剃刀片小心修整聚合块。可将块固定在夹套式固定器上，用解剖显微镜观察，以方便修整。块的横截面应当较小(2 x 2mm)，以获得最佳切片效果。

9.切片：
用干燥的玻璃刀具（如果是硬组织，则用钻石刀具）在超微切片机上切片，或用玻璃刀或钢刀在标准旋转显微镜用薄片切片机上切片。由于聚合GMA比石蜡要硬得多，如果使用钢刀，必须经常磨刀。切片通常厚0.5至2微米。由于静电，干燥切片有时并不好处理。

切片可用钟表匠用的尖头镊或小刷子从刀刃上拿走，并放在显微镜载物片的一滴蒸馏水上。载物品必须清洁，但不应用白蛋白涂层。让水蒸发，切片第二天染色。更加快捷的方式是，用吸纸吸走水分，并风干。切片则可立即染色。

GMA对湿度敏感。如果块太硬而不能切片，则将其放入潮湿空气中1-2小时。相反，如果块太软，则将其放入干燥器中1-2小时。

如果同一嵌入既要用于LM，又要用于TEM，则建议使用TEM配方，因为用TEM块进行厚切片比用LM块进行薄切片要容易得多。

10. 普通染色程序：
我们对传统染色程序稍做了修改。不需要除去塑胶。将干燥载物片放入染色溶液中，或将一滴染色溶液滴在载物片上。可延长染色时间，以增加染色强度。切片紧紧粘附于玻璃，可在水流下漂洗。切片有时在酒精或碱性溶液中脱落或折叠，因此应避免使用这些溶液。重复弄湿和干燥通常并不损坏切片。染色后，将载物片在水中漂洗，风干，滴一滴Euparol或其它装裱液在切片上，然后盖上盖玻片。

参考文献：

  1. Bennett, H. S. et al. ( 1976) 制备用于光学显微镜的嵌入塑胶组织的科学与技术，特别提到，甲基丙烯酸乙二酯、玻璃刀和简单染色。染色技术。 51(2):71-97.
  2. Cole, M.B., Jr. (1968)用于电子显微镜的水溶性嵌入介质紫外聚合的一种简单仪器。J.显微镜 7(3):441-444.
  3. Cole, M.B., Jr.和 J. Ellenger (1981) 光学显微镜下的甲基丙烯酸乙二酯：核酸细胞化学。J. 显微镜。(牛津) 123:75-88.
  4. Cole, M.B., Jr. 和 S.M. Sykes (1974) 光学显微镜下的甲基丙烯酸乙二酯：动物组织嵌入和切片的常规方法。染色技术。49(6) :387-400.
  5. Feder, N. 和 T.O. O'Brien (1968) 植物显微技术：一些原则和新方法。Amer. J. 植物学 55(1):123-142.
  6. Feder, N. (1970) 组织化学培训班笔记。范德比尔特大学。
  7. Kushida, H. (1970) 用甲基丙烯酸(2-羟丙)酯嵌入的新方法。 J. 电子显微镜。19(3):281-282.
  8. Leduc, E.H.和 W. Bernard (1967)甲基丙烯酸乙二酯嵌入程序的最新改进。J.超显微结构研究。19:196-199.
  9. Ruddell, C. L. (1971) 用于1-2微米切片的嵌入介质。 3. 嘧啶激活的甲基丙烯酸羟乙酯-过氧化苯甲酰。染色技术。42(2):77-83.
  10. Cole, M.B., Jr. (1982) 用于光学显微镜染色的骨头与软骨甲基丙烯酸乙二酯嵌入。J. 显微镜。(出版中)。

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Thursday February 09, 2012
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