SPI-Chem™“低酸”GMA套装，硬度适合TEM薄切片

使用说明

英文版

SPI-Chem™低酸GMA水溶性嵌入套装的透射电子显微镜(TEM)应用

SPI #02630-AB和SPI #02630-AA的使用说明

注意：

使用套装前，请通读容器标签上的所有说明与警示。

简介：

甲基丙烯酸- 2-羟基乙酯，俗称“甲基丙烯酸羟乙酯”或 GMA，具有极性水溶性，已经发现在透射电子显微镜(TEM)嵌入生物组织领域越来越多的应用，用于保存和观察之前未用溶剂脱水的精细结构。GMA在聚合过程中只形成非交联直链，因此并不需要硬化剂。用来促进端到端聚合的催化剂是过氧化苯甲酰，最终渗透介质的浓度约为0.6%。

GMA嵌入和特定低酸GMA嵌入，与其它系统相比，具有很多优势：

组织脱水可在GMA的水稀释液中直接进行，或在任意有机溶剂中进行
GMA不需要除去水，事实上它最好在至少有一些水存在的情况下工作。
用单体渗透组织，可在室温或更低温度下进行。
GMA聚合可在周围温度为0°C，用UV辐射到60°C的烤箱中进行。
聚合GMA的薄切片可用玻璃或钻石刀具切割。
低酸GMA切片，不同于普通技术等级的GMA，抗染色，因此大大降低了非特异性背景染色的发生。
酶解作用，多种染色和免疫学定位可在GMA的厚切片上进行，而不需要移除塑胶。

用于TEM的低酸GMA套装由三种成分组成，即甲基丙烯酸羟乙酯单体(低酸)，聚合引发剂或催化剂(过氧化苯甲酰)和增塑剂或填充剂(甲基丙烯酸丁酯)。供应的GMA单体，完全不含甲基丙烯酸，含有少量的抑制剂，以抑制合成和储存过程中的自然聚合。在使用前不需要除去抑制剂。供应的过氧化苯甲酰催化剂为颗粒状。

配方：

用于TEM应用的GMA嵌入混合物是在Cole²(1981)使用的Leduc¹(1967)配方的基础上进行的改进：

用于TEM的GMA成分推荐量

成分：最终介质的标准配方

GMA (低酸)： 67 ml
水： 3 ml
甲基丙烯酸丁酯： 30 ml
过氧化苯甲酰： 0.60g

在下列制备程序中，85%和98%水稀释溶液，和预聚合GMA一样，都是由上述配方制成。降低温度到4-8°C，可增加GMA在水中的溶解度。最终的完整介质，如上所示，可预聚合。

关于储存过氧化苯甲酰的特别说明：避免过氧化苯甲酰失去水分，因为干燥材料危险性要大得多，而且燃烧力强。在38°C(100°F)下存储，以保持产品活性。

关于使用GMA的特别安全说明：液体GMA成分可能使某些人产生严重的接触性皮炎或过敏反应。橡胶手术手套有助于预防接触性皮炎。聚合GMA块似乎不反应，并无毒。

树脂成分的混合：
树脂成分的准备和混合必须充分，并在通风橱中进行。混合物存储于棕色玻璃瓶中，在冷藏柜中可稳定存放6个月以上。使用前，使混合物达到室温，然后再打开容器，以防止冷凝污染溶液。

特别注意事项：
避免过氧化苯甲酰失去水分，因为干燥材料的危险性要大得多，而且燃烧力强。在100°F(38°C)下储存，可保持活性。

液体GMA成分可能使某些人产生严重的接触性皮炎或过敏反应。橡胶手术手套有助于预防皮炎。聚合GMA似乎无毒。

将过氧化苯甲酰溶于水-甲基丙烯酸乙二酯-甲基丙烯酸丁酯混合物。充分混合，然后将足够多的溶液倒入125ml或250ml的Erlenmeyer细颈瓶(Pyrex)，形成薄(5-7mm)层。在本生灯上缓慢加热，不断搅拌。溶液颜色变深(到黄-橙)，并开始变浓时，溶液聚合。溶液开始聚合时，立即将细颈瓶放入冰水浴中，并大力搅拌，直到溶液冷却至冰浴温度。聚合是放热反应，一旦聚合开始，必须迅速冷却，以防止在细颈瓶中迅速完全聚合。如果在初始加热和冷却后，没有达到适当的粘度，根据需要多次重复该程序，直到达到理想粘度。适当预聚合的GMA，其在冰水温度下的粘度应当和浓果汁一样。也就是说，溶液中的小气泡应当缓慢上升到表面。

脱水，渗透和嵌入
小标本(1mm³)或通常用于TEM大小的组织标本可用甲基丙烯酸乙二酯的水稀释溶液脱水。如果大标本用GMA脱水，则不能充分保存组织。将定色^*组织在缓冲液或水中漂洗后，标本或组织标本直接转移到80%的GMA水溶液。GMA脱水、渗透和嵌入的典型进度表如下：

漂洗                        5分钟至1小时。
85% GMA               更换2次，每次1小时。
97% GMA               更换2次，每次1小时。
最终 GMA
嵌入混合物    整夜(非预聚合)

最终嵌入：
将渗透组织和一两滴预聚合GMA放入00型号凝胶胶囊，根据需要确定组织方向，插入识别标签，填充胶囊至顶部或用预聚合GMA形成正液面，然后盖上。氧气抑制聚合。

将胶囊垂直放在胶囊固定器上，并放入配备有2个长波长(3150A)UV灯(G.E. #F6T5,BL)的紫外线仪器中，直到聚合(12-24小时)。如果有空气或水分含量较高，可能需要2-3天完成聚合。

^*避免使用OsO₄定色。见参考文献#4。

如果塑胶上表面呈白色，或用拇指甲不能使其表面凹入，则该塑胶可被视为已聚合。

凝胶胶囊在水中软化后，可能脱落。如果在水中浸泡后除去凝胶，至少24小时以后再切片。GMA对温度敏感。如果块太硬而不能切片，则将其置于潮湿空气中1-2小时。相反，如果块太软，则将其置于干燥器中1-2小时。聚合块可在室温下无限期储存。

薄切片：
在薄切片方面，GMA的切割特征与环氧型、非水溶性树脂大为不同。刀槽中的水位最低时，切片效果最好；仅仅够弄湿刀刃。同时，相对湿度在50%以下时，GMA切割性能更好。而且，切割速度越快，GMA切片越容易。此外，GMA切片进刀角比环氧树脂更锐。

如果要将同一嵌入既用于LM研究，又用于TEM研究，我们建议使用TEM配方。因为用TEM块进行厚切片要比用LM块进行薄切片容易得多。

参考文献：
¹Leduc, E.H. and Bernhard, W., J. 超微结构研究。19, 196 (1967).

²Cole, M.B., Jr.个人通信，1981.

³Cole, M.B., Jr. J. 显微镜(巴黎) 7， 441 (1968)

⁴Barsotti, P. et al. J. 亚显微细胞学12, 233 (1980)

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