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Lowicryl®用于免疫金染色的树脂套装

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Lowicryl® 低温嵌入树脂

简介：

Lowicryl K4M, HM20, K11M,和HM23是以高度交联的丙烯酸脂和甲基丙烯酸酯为基础的嵌入介质，它们是很多嵌入条件的指定产品。见参考文献1, 2,和3。这些树脂在低温下具有低粘性：K4M可用于-35°C(-31°F)，HM20可用于-70°C(-94°F)。K11M和HM23的凝固温度，使得它们可分别用于-60°C和-80°C。所有Lowicryl介质在温度低至-35°C(-31°F)下，显示低粘性。研究人员可以选择极性(亲水的：K4M和K11M)或非极性(疏水的：HM20和HM23)嵌入介质。

Lowicryl树脂是用长波长(360 nm)紫外（UV）光聚合的。由于光聚合的开始很大程度上不依赖于温度，因此块可在与渗透同样的温度下聚合。此外，也有报导快速聚合方法。见参考文献4。

蛋白质和脂蛋白在易与水混合的有机液体中将变性，传统嵌入技术需要使用这些液体。

K4M和K11M的亲水性，使它具有两个独特的优势。在脱水和渗透过程中，标本可保持部分含水的状态，因为K4M和K11M可在块含有5%(重量)水分的情况下聚合。

其次，K4M和K11M对于用抗血清、血凝素和胶体金粒免疫标记切片特别有用。见参考文献5，6，7和8。使用K4M或K11M，结构保存效果更好(见参考文献9)，抗原性保存 也更好，而且背景标记要低得多(见参考文献10, 11, 12, 13, 14, 15)。

HM20或HM23可用于在STEM模式下，通过原子序数对比生成完全未染色薄切片的高对比图象。见参考文献16。HM20和HM23密度低，与传统嵌入介质相比，特别适宜用于暗场观察。它们也能在低至-70°C(-94°F)时常规使用。在这些低温下，生物材料稳定，甚至可以保持其结合水条件。所有Lowicryl树脂都能用于冰冻置换标本。见参考文献17。

制备Lowicryl介质：

Lowicryls为三种成分组成的高纯度系统：

a) 交联剂
b) 单体混合剂
c) 引发剂

树脂稳定，但没有必要在使用前除去稳定剂。通过改变单体与交联剂的比例，可以很容易地调整树脂硬度，以满足特定标本的需要，使用的交联剂越多，块越硬。

例如：

树脂应制备于棕色玻璃容器中，或以别的方式避免光线直接照射。 所有成分都容易互相混合。避免过度搅拌，过度搅拌可能使氧气进入树脂，从而影响聚合。 建议用玻璃棒轻轻搅拌3-5分钟，或用干燥的氮气流穿过树脂以混合。

如下混合物，使块在UV聚合后具有中等硬度：
K4M HM20 K11M HM23 2
-------- -------- -------- --------
交联剂 A 2.70g交联剂 D 2.98g交联剂 1.0g交联剂 1.1g
单体 B 17.30g单体 E 17.02g单体 19.0g单体 18.9g
引发剂 C1 0.10g引发剂 C1 0.10g引发剂 0.1g引发剂 0.1g

1用于K4M或HM20在-50°C(-58°F)至0°C(-32°F)下聚合。在0°C以上，可用同等数量的安息香乙醚代替引发剂。室温固化块在几小时后，即可用于切片。

2 -50°C(-58°F)以上，安息香甲醚；-50°C(-58°F)以下，则Igracure 651。

可使用任何标准乙醛定色程序。由于树脂在大多数情况下是光聚合，通常并不推荐同时具有染色性能的定色剂(如四氧化锇)(见参考文献18)。

下面是乙醇的典型脱水渗透进度表，可用于Lowicryl树脂：
乙醇，体积% 温度，°C 时间，分钟
------------------------- ---------------------- ------------------
30 0 30
50 -20 60
70 -35 (-50) 3 60
95 -35 (-50 至 -80) 3 60
100 -35 (-50 至 -80) 3 60
100 -35 (-50 至 -80) 3 60

树脂：乙醇，体积：体积 温度，°C时间，分钟
---------------------------------------------------------------------
1:1 -35 (-50 至 -80) 3 60
2:1 -35 (-50 至 -80) 3 60
100% 树脂 -35 (-50 至 -80) 3 60
100% 树脂 -35 (-50 至 -80) 3 整夜或4-16小时

3 建议在低温下进行，可能只用于HM20(-70°C)、HM23(-80°C)和K11M(-60°C)。

在低于0°C的所有温度下，必须小心，不要让标本中残留的水在脱水过程中结冰。可开发任何其它温度或极性脱水剂的多种进度表，只要溶解度允许，包括冰冻置换法。

使用更低温度的生物学结果有待探究。至今没有关于在这些低温下脱水的完整性的确切资料。由于水分损失而未成功的，如在块的棱椎上，不应当被机械地认为是“渗透不好”。液体在低温下所表现出来的持续性似乎不会引起渗透问题。见参考文献19。

另据报道，有避免低温而使用HM20的一种快速定色和嵌入方法，见参考文献20。

聚合：

树脂用360 nm的长波长UV间接照射聚合，通常使用两个15瓦特(FEI/飞利浦TLAD 15W/05或其它相当的替代品)光源，-30°C至-40°C，距离为30-40厘米，时间为24小时。硬化可以在满装量的凝胶胶囊、BEEM®胶囊，或SPI UV透明硅树脂扁平嵌入模具中进行。

缓慢聚合，特别是使用漫射辐射，生成上好的块，没有严重的收缩效果。可切片的准备在12小时内就能生成，虽然在室温下用UV光照进一步硬化2－3天能改进切片质量。

切片和染色：

用钻石刀具或玻璃刀具能使Lowicryl轻易生成银色至灰色的切片。 用乙酸铀酰和Reynold's柠檬酸铅能轻易进行最佳染色。由于氧化重金属，如四氧化锇(OsO4)或高锰酸钾(KMnO4)会与树脂发生反应，染色效果较差。

锇氨B在低pH值时显示核酸的强特异性(见参考文献21)。

安全和存储：
请务必在使用前仔细查看这些树脂产品的MSDS。处理这些材料时，如 SPI Supplies® 牌乙烯基手套，始终使用防护手套。

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Thursday February 09, 2012
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