LR Gold树脂系统

技术资料表：处理与聚合

虽然使用如下进度表，成功地处理了5 x 5 x 5 mm的组织样品，但我们建议使用不超过3 x 3 x 3 mm 的组织样品。而且，通常来说，样品越小，注入越有效。组织的厚度，对聚合深色组织尤为重要，如肝脏和脾。因为完全聚合取决于来自光源的蓝光穿透整个组织。所使用的组织应当是新鲜而未固定的。

处理

将10 ml有严密盖子的小瓶置于旋转式搅拌机上，在如下表所列的温度下，进行处理。相关液体必须在零度以下散装储存。此外，必须记住，混合树脂对延长光照敏感。因此，应当储存于暗处，并尽量少接触。我们推荐使用聚乙烯吡咯烷酮保护未固定的组织，防止处理过程中渗透变化。我们使用过分子量约为44,000的PVP。它可溶于甲醇、水、或伦敦树脂金单体。甲醇混合物中，可以达到50% w/v的浓度。然而，低温下，更高的粘性是不切实际的。下表列有推荐PVP浓度。

虽然该协议用于LM能产生令人非常满意的结果，必须说明的是，加入不同浓度的PVP，可能进一步改进形态，特别是对于EM。

新鲜组织

50% 甲醇，20% PVP*	0°C	15 分钟
50% 甲醇，10% PVP	-25°C	45 分钟
30% 甲醇，10% PVP	-25°C	45 分钟
50% LRGold 单体 / 50% LRGold 甲醇，10% PVP	-25°C	30 分钟
70% LRGold 单体/ 30% LRGold 甲醇，10% PVP	-25°C	60 分钟
100% LRGold 单体	-25°C	60 分钟
100% LRGold 单体 + 引发剂	-25°C	60 分钟
100% LRGold 单体 + 引发剂	-25°C	整夜
100% LRGold 单体 + 引发剂	-25°C	20-25 小时聚合
* 100ml 甲醇中20g PVP

聚合

需要加入光敏引发剂来聚合树脂。我们推荐苯偶酰，一种 α-二酮，浓度为 0.1% w/v。原理如下图所示。

最好不要在反应前将切片装裱于载玻片，
因为它含有热量，将损害未固定的蛋白质。
当然可以在酶组织化学或免疫细胞化学进行后，
将切片按通常方法装裱。

凝胶胶囊尺寸为00，塑胶支持物为改良红血球凝聚托盘。使用的灯泡为Thorn投射灯(AI/209 FDX, 12V100W)。我们发现 7至9V将在24小时内凝固。对许多丙烯酸树脂，氧气将抑制聚合，因此，胶囊应当填满，盖紧。可在胶囊内插入纸标签。一次可聚合9个胶囊(3x3)。如果24小时后，上表面仍然是软的，可以进行修剪，或者白天硬化几个小时，然后才除去胶囊。一旦聚合，块不再需要冷藏存储，但冷藏存储可延长一些酶的活性。

到目前为止，使用这种树脂进行的酶组织化学都使用了传统试剂、反应时间和温度 (见Thompson 和 Germain, 组织化学杂志，第15卷，第12期，1983年12月 )。

室温聚合，使用过氧化氢/胺固化，在纯 LRGold中加入1%的干燥过氧化苯甲酰，或更加稳妥地，加入1.5%的过氧化苯甲酰糊 (60%邻苯二甲酸二丁酯)。用纯LRGold溶液渗透，在聚合前加入过氧化氢混合物。将模具放在冰水中冷却，减少固化热量。为了加速固化，可在20ml LRGold树脂/过氧化苯甲酰混合物中加入一滴LRWhite加速剂。对于U.V.光固化，可加入安息香甲醚。醚的精确浓度取决于UV灯具的功率和发射光谱。然而，有效的起始浓度为0.5%。

最终树脂的交连密度非常重要。如果染色渗透不够迅速，降低苯偶酰浓度，而不要降低光照强度或光照时间。

LRGold块聚合后，可在室温存储，处理和切割。最好使用机动显微镜用薄片切片机和玻璃刀具切割。切片可干燥切割，拿起放在孵化介质或缓冲洗涤液中自由漂浮，用于酶组织化学或免疫细胞化学。

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